甜橙在鮮食和加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量果皮垃圾，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。然而，這些“廢料”是精油、類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素等生物活性化合物的重要來(lái)源。甜橙精油因其令人愉悅、舒緩情緒等功效而廣受喜愛(ài)，并且在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)都有很大的需求。
材料與試劑
塔羅科血橙；贛南臍橙。原料均成熟期采摘，采后挑選無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)。
儀器與設(shè)備
Heracles NEO超快速氣相電子鼻，高速破壁機(jī)，旋轉(zhuǎn)錐蒸餾塔，風(fēng)分析儀。
方法 GC-IMS分析 取100uL樣品于20mL頂空瓶中，40℃孵化10min。進(jìn)樣針溫度為85°C，頂空進(jìn)樣100μL。
電子鼻分析
Heracles NEO超快速氣相色譜電子鼻配制雙FID檢測(cè)器，采用MXT-5和MXT-1701兩根色譜柱（10m，180μm）進(jìn)行分析。取100μL樣品于頂空瓶中，40℃孵化15min，進(jìn)樣量500μL，進(jìn)樣口溫度200℃，壓力10kPa，分流10mL/min。升溫程序?yàn)?℃/s升至180℃，保持60s；3℃/s升至250℃，保持120s。 相對(duì)氣味活度值（ROAV）
引入ROAV評(píng)價(jià)各揮發(fā)性化合物對(duì)甜橙精油風(fēng)味的貢獻(xiàn)度。ROAV值越大的化合物對(duì)樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)度也越大。本研究認(rèn)為ROAV≥1的化合物為甜橙精油的關(guān)鍵氣味化合物。設(shè)定對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)度最大的化合物的ROAV為100，其他化合物的ROAV則按下式計(jì)算：
式中：Ci、Ti分別為各揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量（%）和氣味閾值（mg/kg）；Cstan、Tstan分別為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)度最大化合物的相對(duì)含量（%）和氣味閾值（mg/kg）。
感官定量描述分析
如圖1所示，對(duì)不同甜橙精油的香氣屬性（果香、花香、甜香、青香、脂香、木香）及整體喜愛(ài)度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，CP精油具有最強(qiáng)烈的果香、甜香和花香，并且整體喜愛(ài)度最高；而MADH精油則表現(xiàn)出更強(qiáng)的青香、脂香和木香。SCC萃取液各香氣屬性強(qiáng)度相對(duì)較低，但在血橙精油中喜愛(ài)度不亞于MADH精油。此外，臍橙精油相較于血橙精油具有略微更強(qiáng)的果香和喜愛(ài)度。
圖1 甜橙精油感官分析結(jié)果：(A)血橙精油；(B)臍橙精油
GC-IMS鑒定六種甜橙精油揮發(fā)性成分 不同甜橙精油GC-IMS譜圖分析
六種不同甜橙精油的GC-IMS測(cè)定結(jié)果如圖2所示。整個(gè)GC-IMS譜圖以藍(lán)色為背景，橫坐標(biāo)1.0處的紅色豎線為反應(yīng)離子峰（RIP），兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性物質(zhì)。顏色反映了峰強(qiáng)度，白色表示峰強(qiáng)度較低，即物質(zhì)濃度較低，紅色則表示物質(zhì)濃度較。由此可以看出甜橙精油的揮發(fā)性成分得到了較好分離，CP和MADH提取的精油譜圖較相似，但和SCC萃取液的譜圖有明顯差異，前兩者峰強(qiáng)度和個(gè)數(shù)明顯高于后者。以縱坐標(biāo)來(lái)看，保留時(shí)間200s內(nèi)，相比于CP精油，MADH精油和SCC萃取液具有更多種類(lèi)的揮發(fā)性物質(zhì)，說(shuō)明加熱提取過(guò)程中生成了一些新的化合物；200-400s間，MADH精油具有最高含量的揮發(fā)性物質(zhì)；400s-700s間，CP和MADH精油出峰情況相似，而SCC萃取液在此期間只有少量化合物出峰。 為了更直觀展現(xiàn)樣品間差異，將血橙冷壓精油譜圖作為參比，其余五個(gè)樣品譜圖均扣減參比，紅色表示此樣品中該化合物濃度高于參比譜圖，藍(lán)色表示該化合物濃度低于參比譜圖。根據(jù)圖2C可以看出，不同品種和提取方式對(duì)甜橙揮發(fā)性成分均有影響。MADH精油的譜圖多個(gè)峰顯現(xiàn)紅色，說(shuō)明該方式提取的精油相比于CP含有更豐富的揮發(fā)性物質(zhì)；SCC萃取液的譜圖則顯現(xiàn)大面積藍(lán)色，說(shuō)明香氣化合物含量極低，這和感官結(jié)果一致。此外，血橙精油和臍橙精油相比也有一定差異。
圖2 六種甜橙精油的揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS二維（A）、三維（B）和二維差異譜圖（C）
甜橙精油揮發(fā)性成分定性定量分析 為進(jìn)一步確定不同甜橙精油中具體化合物的差異，對(duì)各成分進(jìn)行定性（表2），并根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)含量（表3）。一共鑒定出64種化合物，包括萜烯類(lèi)23種、醇類(lèi)12種、醛類(lèi)12種、酯類(lèi)4種、酸類(lèi)6種、其他7種。此外，構(gòu)建了指紋圖譜（圖3），直觀地反映出不同樣品間揮發(fā)性成分差異。
表2甜橙精油揮發(fā)性成分定性分析
表3 甜橙精油揮發(fā)性成分的相對(duì)含量
甜橙精油關(guān)鍵揮發(fā)性化合物分析
不是所有揮發(fā)性成分都對(duì)甜橙精油特征香氣有貢獻(xiàn)，有的化合物相對(duì)含量高但氣味閾值高，因此對(duì)樣品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)度不大，利用ROAV法結(jié)合GC-IMS分析結(jié)果可以篩選出甜橙精油的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物。本實(shí)驗(yàn)中，氣味閾值為化合物在油中的閾值，來(lái)自電子鼻軟件中自帶的AroChembase數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)參考文獻(xiàn)。如表4可知，共有16種揮發(fā)性化合物ROAV≥1，對(duì)柑橘香氣貢獻(xiàn)較大。在CP精油中，β-月桂烯相對(duì)含量高且香氣閾值低，風(fēng)味貢獻(xiàn)最大；而在MADH精油和SCC萃取液中，芳樟醇是風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)，在之前的研究中芳樟醇也被認(rèn)定為6種柑橘精油中ROAV=100的物質(zhì)。大部分萜烯類(lèi)化合物ROAV≥1，如β-蒎烯、α-萜品烯等，并且它們?cè)贑P精油和MADH精油中的貢獻(xiàn)度遠(yuǎn)大于SCC萃取液中。2-己醇、(E)-2-己烯醛和正辛醛是六種樣品共有的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物。此外，二甲基二硫醚和二乙基三硫醚這兩種硫化物閾值較低，對(duì)MADH精油風(fēng)味具有很大貢獻(xiàn)度，這也是MADH精油喜愛(ài)度較低的重要原因。
基于PLS-DA和VIP值篩選六種精油差異揮發(fā)性化合物
為了篩選六種精油的差異揮發(fā)性化合物，基于GC-IMS檢測(cè)到的64個(gè)物質(zhì)的峰信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。如圖4A所示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為74.1%和10.7%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.8%，表明該模型能夠充分反映樣品原始信息。每一聚類(lèi)中的3個(gè)點(diǎn)緊密聚集在一起，說(shuō)明組間重復(fù)性好，GC-IMS檢測(cè)性能穩(wěn)定。可以看出六種樣品有明顯的區(qū)分，NO_CP和NO_MADH均分布在上方區(qū)域，兩者差異較小；BO_CP和BO_MADH均分布在左下方，兩者也較為相似；BO_SCC和NO_SCC均分布在右側(cè)區(qū)域，同樣具有一定相似性。對(duì)于同一種甜橙，CP和MADH兩種方式提取的精油距離相近，但和SCC萃取液相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明前兩種方式和后者提取的揮發(fā)性成分差異較大。此外，同一種方式提取的兩種甜橙精油，如BO_CP和NO_CP，BO_MADH和NO_MADH，揮發(fā)性成分也具有較大差異。 進(jìn)一步地，利用變量投影重要性（VIP）篩選對(duì)樣本分類(lèi)貢獻(xiàn)大的揮發(fā)性化合物。VIP通過(guò)PLS-DA載荷圖判別所得，VIP值越大，表明對(duì)樣本分類(lèi)的貢獻(xiàn)越大，通常VIP>1表明該變量在區(qū)分不同樣本上起著至關(guān)重要的作用。如圖4B所示，共篩選出15種VIP>1的標(biāo)志性差異化合物，包括1-正戊醇（D）、3-蒈烯（Tr）、β-蒎烯（M）、2-己醇（D）、3-蒈烯（D）、未知20、β-月桂烯（D）、β-蒎烯（Tr）、莰烯（D）、芳樟醇（M）、β-月桂烯（Te）、未知37、β-蒎烯（Te）、莰烯（M）和3-蒈烯（Te）。其中絕大部為萜烯類(lèi)化合物，少數(shù)為醇類(lèi)，說(shuō)明提取方式及柑橘品種對(duì)這兩類(lèi)化合物影響較大。
圖4 基于GC-IMS檢測(cè)的甜橙精油揮發(fā)性成分的PLS-DA得分圖（A）及VIP得分（B）
超快速氣相電子鼻分析六種甜橙精油揮發(fā)性成分
利用超快速氣相電子鼻可以快速檢測(cè)樣品中揮發(fā)性成分。根據(jù)氣相色譜的峰面積和保留時(shí)間繪制雷達(dá)指紋圖譜，可以反映氣味成分的強(qiáng)度和豐度，結(jié)果如圖5所示，CP和MADH精油的色譜圖相似，基本重合，但與SCC萃取液的色譜圖差異較大，后者的峰強(qiáng)度明顯更低，這與上述GC-IMS譜圖結(jié)果一致。
圖5 基于電子鼻分析的甜橙精油雷達(dá)指紋圖譜：（A）血橙（B）臍橙
通過(guò)電子鼻軟件的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析模塊進(jìn)行主成分分析（PCA）和判別因子分析（DFA），進(jìn)一步區(qū)分不同甜橙精油的揮發(fā)性成分差異。結(jié)果如圖6A所示，PC1、PC2和PC3的累積方差貢獻(xiàn)率均超過(guò)99.999%，說(shuō)明PCA模型對(duì)總方差的解釋效果很好。每組樣品間的點(diǎn)聚集緊密，說(shuō)明重復(fù)性好。GF_SCC和HY_SCC組間距離相對(duì)較近，表明這兩種樣品的香氣差異較小。除此之外，其他樣品的區(qū)域劃分極為明顯。此結(jié)果也與上述PLS-DA一致。與PCA相比，DFA是一種有監(jiān)督的分類(lèi)方法，它能夠增加組間方差并減少組內(nèi)方差，從而實(shí)現(xiàn)更好的分類(lèi)效果。DFA總方差可達(dá)96.052%（PC1=86.785%，PC2=9.267%），表明不同柑橘品種和提取方法的具有明顯的區(qū)域分布特征，并進(jìn)一步驗(yàn)證了PCA結(jié)果。綜上所述，超快速氣相電子鼻可以很好地區(qū)分不同甜橙精油的揮發(fā)性成分差異。
圖6 基于電子鼻分析的六種甜橙精油PCA（A）和DFA（B）分類(lèi)結(jié)果
本研究采用感官定量描述、GC-IMS及超快速氣相電子鼻分析不同甜橙精油風(fēng)味特征及揮發(fā)性成分。感官結(jié)果表明，CP精油具有濃郁的果香、甜香和花香且喜愛(ài)度最高，MADH精油則表現(xiàn)出更強(qiáng)的脂香、青香和木香，而SCC萃取液香氣濃度較低。GC-IMS鑒定出64種揮發(fā)性化合物，主要為萜烯類(lèi)、醇類(lèi)和醛類(lèi)，其次是酸類(lèi)、酯類(lèi)和其他化合物。萜烯類(lèi)在CP和MADH精油中含量明顯高于SCC萃取液，而醇類(lèi)和醛類(lèi)在MADH精油和SCC萃取液中含量明顯高于CP精油。基于ROAV鑒定出16種關(guān)鍵揮發(fā)性成分，其中β-月桂烯和芳樟醇對(duì)甜橙精油風(fēng)味貢獻(xiàn)最大。結(jié)合PLS-DA成功區(qū)分六種精油，并基于VIP>1篩選出15種差異揮發(fā)物，分別是1-正戊醇（D）、3-蒈烯（Tr）、β-蒎烯（M）、2-己醇（D）、3-蒈烯（D）、未知20、β-月桂烯（D）、β-蒎烯（Tr）、莰烯（D）、芳樟醇（M）、β-月桂烯（Te）、未知37、β-蒎烯（Te）、莰烯（M）和3-蒈烯（Te）。此外，超快速氣相電子鼻結(jié)合PCA和DFA也成功區(qū)分六種甜橙精油風(fēng)味差異。
本研究以血橙和臍橙作為代表性甜橙果實(shí)原料，采用冷壓法（CP）、微波輔助水蒸氣蒸餾法（MADH）和SCC三種方法提取甜橙精油，利用氣相離子遷移色譜（GC-IMS）和超快速氣相電子鼻分析不同甜橙精油風(fēng)味組成，并結(jié)合偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、主成分分析（PCA）和判別因子分析（DFA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)篩選不同甜橙精油風(fēng)味差異化合物。
材料與方法
結(jié)果與分析
圖3 甜橙精油的揮發(fā)性成分GC-IMS指紋圖譜
表 4 甜橙精油中揮發(fā)性化合物的 ROAV 值
結(jié)論
來(lái)源：感官科學(xué)與評(píng)定，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)源。
參考文獻(xiàn)：劉菲斐,陳晉,陳健樂(lè)等.基于化學(xué)計(jì)量學(xué)鑒定不同甜橙精油揮發(fā)性成分[J/OL].食品科學(xué),1-16[2024-03-22].
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